实验九植物细胞的悬浮培养（选做）【目的】通过科研项目与教学相结合，将除虫菊愈伤组织或实验二中诱导的胡萝卜和烟草的愈伤组织进行初代与继代悬浮培养，使学生通过植物细胞小规模生产的尝试，为植物细胞次生代谢产物的规模化生产奠定基础。【要求】以植物离体诱导的愈伤组织为材料，配制相应培养基，进行细胞离体培养。掌握植物细胞初代悬浮培养操作技术；植物细胞继代悬浮培养操作技术；液体培养基的配制方法；学会植物细胞的小规模化生产；植物细胞悬浮培养的观察。【内容】1、愈伤组织诱导2、愈伤组织的振荡悬浮培养3、细胞的悬浮培养【用具】超净工作台、倒置显微镜、恒温培养室、高压灭菌器、冰箱、恒温培养箱、培养瓶、三角瓶、烧杯、枪形镊子、酒精灯等。【药品】①按照培养基要求准备药品；②材料表面消毒剂：70%乙醇。【实验材料】除虫菊愈伤组织或实验二中诱导的胡萝卜和烟草的愈伤组织。除虫菊愈伤组织继代培养基：MS+BA0.2+NAA1.0+2,4-D2.0+（KT0.4）+30g蔗糖+5.5g琼脂，PH5.8。除虫菊细胞悬浮培养基：MS+2,4-D4.0+NAA0.1+6-BA0.3+30g蔗糖，PH5.8。【方法】第一部分从除虫菊经提取和加工后获得的除虫菊酯生物农药，具有快速、高效、安全的优点。目前除虫菊酯主要从除虫菊干花中提取，其环节多，耗时费力，且产量受环境和季节限制,以致除虫菊酯的生产成本高，产量低，难以满足市场需求，本试验以除虫菊花蕾为材料，诱导愈伤组织，进行细胞的悬浮培养，获得了较为稳定的细胞悬浮系，并对悬浮细胞生长的优化条件进行探讨，目的是用植物生物反应器建立大规模除虫菊细胞培养体系，大量生产除虫菊酯等杀虫成分，进而工厂化生产天然除虫菊酯杀虫剂。植物反应器生产除虫菊酯可节约土地投资小产出高，有一定的开发前景。国内关于细胞悬浮培养尚未见报道。实验步骤：除虫菊愈伤组织诱导：取除虫菊未成熟花蕾，于4℃下处理24h，70%乙醇30s，0.1％HgCl2消毒5min，无菌水冲洗3～4次，剥去花萼后接种。初始诱导及继代培养基为：MS+2,4-D2.0+NAA0.1+6-BA0.1+20g蔗糖，琼脂5g，pH5.8；花蕾接入15d后开始出现愈伤组织，初期生长缓慢，转入继代培养基后，愈伤组织生长加快，1个月后可以增重数倍，出现了多种类型的愈伤组织，黄色或淡黄色的愈伤组织的细胞大多为圆形，细胞之间联系紧密，多个细胞成为细胞团。每隔20d继代1次。2、除虫菊细胞悬浮培养：(1)除虫菊细胞初代悬浮培养：初始液体培养基同上，不加琼脂。取1.5g继代培养20d的愈伤组织，接入装有30ml液体培养基的100ml三角瓶中进行细胞悬浮培养，摇床转速为80rpm,12d继代1次，筛选建立稳定的细胞悬浮培养系。细胞学观察显示：黄色或淡黄色愈伤组织转到液体培养基上进行悬浮培养，初期的细胞不规则，细胞质稀薄，有许多长形的细胞出现，每隔12d继代1次，随着继代次数的增加，不规则的细胞减少，圆形或椭圆形的细胞增多。（2）筛选除虫菊细胞悬浮培养的适宜培养基：正交实验因素水平水平因素ABCD2，4-DNAA6-BASucrose12320.10.120.00030.30.230.00040.60.340.000正交试验L9（34）ABCD细胞增加量编号DWg·L-1111110.2060212220.2232313330.1856422310.1684523120.2016621230.1892733210.1356831320.2468932130.2280K10.61480.64200.63560.5100K20.55920.61960.54800.6716K30.61040.52280.60080.6028k10.20480.21400.21200.1700k20.18640.20640.18680.2240k30.20360.17440.20040.2008R0.01840.03960.02520.0540主→次D＞B＞C＞A采用L9（34）表头设计进行正交试验，测定各组合不同培养基成份影响悬浮细胞生长量(干重)，并进行方差分析的结果表明，D因素（蔗糖）R值为0.0540，大于B因素(NAA)、C因素(6-BA)和A因素(2,4-D)的R值。极差愈大，反映此种因素水平变动时，指标的变化愈大，即该因素对指标的影响愈大。由此判断各因素对指标影响的主次顺序为：蔗糖＞NAA>6-BA＞2,4-D，即蔗糖对细胞生长的影响最大。根据正交实验确定8号MS+2,4-D4.0+NAA0.1+6-BA0.3+30g蔗糖，PH5.8为除虫菊细胞的适宜培养基。（3）除虫菊细胞的生长和生长进程除虫菊悬浮细胞生长量随着时间的变化约