第五章原生质体的培养教学目标(1)了解原生质体培养的意义；(2)掌握原生质体分离的大致步骤；(3)掌握原生质体培养的方法；(4)掌握原生质体融合的方法。一、原生质体培养的意义1、原生质体(protoplast)原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞，是能存活的植物细胞的最小单位。亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。2、原生质体研究进展植物原生质体培养研究中几个值得提出重要成就：1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。直至1960年纤维素酶和离析酶成为商品酶投入市场以后，植物原生质体研究才成为一个热门的领域。1971年，Takebeetal.首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。1985年，Fujimuraetal.第一例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株。1986年，Spangenberg.单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。至今从植物体的几乎每一部分都可分离得到原生质体。此外原生质体融合，体细胞杂交的技术得到广泛的应用。据统计目前已有49个科，146个属的320多种植物经原生质体培养得到了再生植株（1993）。其趋势仍以农作物和经济作物为主，但从一年生向多年生、草本向木本、高等植物向低等植物扩展。3、原生质体培养的意义(1)再生植株由原生质体再生成植株，不论在进行细胞生物学或生物合成和代谢的实验研究上，还是在组培实践中，都有一定的优点：①可利用均一的分化细胞群体；②因无细胞壁，试剂对细胞作用更为直接，其反应能直接测量，以使反应产物能较快的分离出来；③在理论和实践中，可极大节省空间，如在一个三角瓶就能培养210个细胞，但在大田种植需要4亩地；④可缩短实验周期，如悬浮培养时仅需1~2个小时。原生质体培养可在遗传学方面进行基因互补，不亲和性，连锁群和基因鉴定，分析基因的激活和失活水平的研究。在研究分化问题时，用一个均一的原生质体群体可以筛选数以千计的不同。营养和激素条件，探索诱导单细胞的分化条件等。(2)用于远缘体细胞融合，进行体细胞杂交。这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。首先，两个原生质体融合形成异核体，异核体再再生细胞壁，进行有丝分裂，发生核融合，产生杂种细胞，由此可培养新的杂种。二原生质体的制备（分离）分离原生质体，必须去掉由果胶质、纤维素和半纤维素及木质素等构成的细胞壁。最初是采用机械分离法。即将叶肉细胞，愈伤组织和液体悬浮培养细胞置于高渗的糖液中，使之质壁分离，原生质体收缩成球形。然后用剪刀剪碎组织，就可切开细胞壁获得少量完整的原生质体。不过这种方法分离的原生质体太少，而且只能适于部分组织，Cocking发明的酶解法，开创了大量分离原生质体的新技术，现普遍采用酶分离法来获得原生质体。1、用于分离原生质体的材料准备植物材料一般来说，植物各个器官，如：根、茎、叶、花、果实、种子及愈伤细胞和悬浮细胞等都可作为分离原生质体的材料。但是，要获得高质量的原生质体，则须选用生长旺盛、生命力强的组织作材料，如无菌试管苗叶片、上胚轴和子叶、培养细胞。1.细胞悬浮培养物在建立细胞悬浮培养物之前，需提前培养愈伤组织。即取用成熟种子胚、未成熟胚、幼穗、花药、胚芽鞘或幼叶，经无菌消毒后，在26℃黑暗条件下，在含2,4-D2~4mg/L的MS固体培养基上，诱导愈伤组织，每隔2~4d转接一次。从中选出增殖较快而且呈颗粒状的愈伤组织，或经继代培养一次后，转移到液体培养基的l00ml三角瓶中进行悬浮培养。具体方法是用旋转式振荡器，速度控制在80~120r/min，在25土1℃下暗培养。悬浮培养初期应每隔3d继代一次，一个半月后，吸取4~5ml悬浮细胞转到250ml三角瓶的40ml新鲜培养中，以后每隔7d继代一次。通常经悬浮培养3~4月后，悬浮培养细胞的大小变得较为一致，且细胞质变得较浓时，可用作分离原生质体。2.叶肉细胞叶肉细胞是分离原生质体的最好的材料，用叶片的薄壁组织为材料来源，既要考虑植株的生长环境，又要考虑叶片的年龄及其生理状态对原生质体分离的影响。取生理状态适宜的叶片，有利于原生质体的细胞再生和分裂。要获得良好的培养材料，