SMARTer™RACEcDNA扩增试剂盒实验流程SMARTer™RACEcDNA扩增试剂盒操作一览(PT4096-2)本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMARTerRACEcDNA扩增试剂盒(Cat.Nos.634923&634924)的说明书。一、RACE-ReadycDNA的准备为了获得RACE-ReadycDNA(说明书的SectionV)，请准备5’-&3’-RACE-ReadycDNA合成反应体系，共需要4个反应管，每管均为10µl反应体系。1.混匀以下试剂，并瞬时离心。在进行Step7前，将反应管室温放置:2.0µl5XFirst-StrandBuffer1.0µlDTT(20mM)1.0µldNTPMix(10mM)4.0µl总体积2.分别向这些管中加入对应的以下试剂：准备5'-RACE-ReadycDNA准备3'-RACE-ReadycDNA1.0–2.75µlRNA*1.0–3.75µlRNA*1.0µl5'-CDSPrimerA1.0µl3'-CDSPrimerA*使用1µl对照小鼠心脏总RNA(1µg/µl)。3.将step2中的5'-RACE-ReadycDNA定容至3.75µl；将3'-RACE-ReadycDNA定容至4.75µl。4.混匀试剂，瞬时离心。5.72°C孵育3min，然后42°C冷却2min。最后14,000rpm离心10sec。注意:此步骤在PCR仪中进行，在孵育时，准备step7。6.向5’RACE反应管中各加入1µlSMARTerIIAoligo，混匀后瞬时离心。7.室温下，按顺序混匀以下试剂：4.0µlBufferMix（Step1）0.25µlRNaseInhibitor(40U/µl)1.0µlSMARTScribe™ReverseTranscriptase(100U)5.25µl总体积8.将分别向Step5和step6中变性的RNA反应物管中加入Step7中的5.25µl混合物，每管体积均为10µl。9.使用枪轻柔地混匀试剂，瞬时离心。10.42°C孵育90min。11.70°C加热10min终止反应。12.用TE缓冲液稀释第一链反应产物：•Add20µlifyoustartedwith<200ngoftotalRNA.•Add100µlifyoustartedwith>200ngoftotalRNA.•Add250µlifyoustartedwithpolyA+RNA.13.反应产物–20°C可保存最多3个月。二、快速扩增cDNA末端(RACE)阳性对照RACEPCR实验(说明书的SectionVI.B)快速扩增cDNA末端(RACE)(说明书的SectionVI.D)基因特异性引物(GSPs)：1SMARTer™RACEcDNA扩增试剂盒实验流程•23–28nt•50–70%GC•Tm≥65°C；最好使用Tm>70°C(用于使用降落(touchdown)PCR)•与UniversalPrimerMix3’-end不能有配对使用TFR（看家基因）primers和UPM扩增阳性对照的5’-和3’-RACE。尽管试剂盒中提供有NestedUniversalPrimerA(NUP)，但在SMARTerRACE扩增中并不是必须进行nestedPCR扩增的。请注意，所有的RACEPCR反应都是针对Advantage®2PolymeraseMix优化的。1.各准备50µl的5’-和3’-RACE反应体系，按照顺序混匀以下试剂：34.5µlPCR-GradeWater5.0µl10XAdvantage2PCRBuffer1.0µldNTPMix(10mM;inSMARTerRACEorAdvantage2PCRKit)1.0µl50XAdvantage2PolymeraseMix41.5µl总体积2.旋涡混匀试剂(切勿产生气泡)，瞬时离心。3.5’-RACE:按照TableI准备反应体系。3’-RACE:按照TableII准备反应体系。.在0.5mlPCR离心管中按照顺序加入试剂，轻柔混匀。*若您的RNA样本不是哺乳动物样本，请忽略此反应。或将引物换成您的样本的看家基因进行扩增。†若没有设计overlappingRACE片段，请忽略此反应。2SMARTer™RACEcDNA扩增试剂盒实验流程*若您的RNA样本不是哺乳动物样本，请忽略此反应。或将引物换成您的样本的看家基因进行扩增。†若没有设计overlappingRACE片段，请忽略此反应。4.选择下列合适的扩增程序进行PCR扩增。