介绍&协议概述TheSMARTerRACEcDNA扩增试剂盒提供了一种执行包括5’和3’cDNA末端快速扩增的方法(RACE)，这种试剂盒是改进版本，包括一种新的SMARTerIIA低聚核苷酸SMARTScribe反转录，它提供了更好的敏感性,更少的背景材料和较高的特异性，这种强大的系统允许您从只有10ng总RNA中隔离你的完整的目标转录本的5’序列，TheSMARTerRACEcDNA扩增试剂盒的基础是一种智能技术，它在RACEPCR中排除了有问题的接头连接的需要，让你直接用第一条cDNA，使RACE更快更简便，另外SMARTerRACE试剂盒利用Clontech专利的抑制PCR和跨步PCR以提高RACE反应的敏感性降低背景材料。结果是您可以使用polyA+或总RNA作为构建甚至非常少的转录本的完整的cDNAs的开始材料。SMART智能技术在反转录反应中提供了一种合成全长cDNAs机制。使得SMARTerIIA低聚核苷酸和SMARTScribe反转录联合反应成为可能。这个SMARTScribe反转录,一旦到达RNA模板的末端,就表现出末端转录的活性,使第一股cDNA的3'端增加3–5个残基(图1)这个SMARTer低聚糖包含一个使延长的cDNA尾巴退火的修饰碱基的末端延伸，从而允许这个低聚糖作为反转录的模板，SMARTScribe反转录从mRNA分子到SMARTer低聚糖改变模板，产生一个的初始RNA的完整cDNA复制其末端有额外SMARTer序列。由于这种模板仅当酶到达RNA模板末端时改变反转录活性。这个SMARTer序列通常仅仅纳入到第一条全长cDNAs。该技术更多信息请阅读···。这个过程保证高质量的RNA的使用将使得一套有最大数量的5'序列cDNAs的形成。在反转录之后SMART技术允许第一条cDNA链在5'-3'RACEPCR反应中直接使用。第一条cDNA合成时在单步中通用引物结合位点的合并排除了冗长的第二条链的合成和接头连接的需要。这个简单的和高效的SMARTercDNA合成方法在扩增你的目标cDNA时确保更高的特异性。抑制PCR及跨步PCR技术与SMARTer技术结合在RACEPCR扩增中降低背景材料。SMARTerRACEcDNA扩增的唯一需要是要知道最少23-28个核苷酸序列信息，目的是为5'-3'RACE反应设计基因特异性引物。（额外的序列信息将会有助于你的RACE产品的分析）这有限的需要通过多种方法表征基因特征使得SMARTerRACE更加理想,方法包括cDNA敲除、差异显示，RNA的指纹图，est，文库筛查等。SMARTerRACEcDNA扩增是一个灵活的工具。许多研究人员使用这个试剂盒代替传统的试剂盒来扩增特意cDNA的仅5'或3'端。其他人执行包括5'和3'RACE中,然后使用后面协议的部分介绍了这个两种方法之一继续克隆全长cDNAs。在许多情况下,研究人员获得完整的cDNAs不用构建或筛选cDNA文库。下面的表描述了生成RACE准备的cDNA、执行5'&3'RACEPCR反应,和用SMARTerRACEcDNA扩增试剂盒描绘最终RACE产品结果的必要步骤。请参阅执行每步细节的特别部分。RACE的详细机制参考附录A&B。步骤描述部分引物设计你必须为5'和或3'RACEPCR反应设计特异性引物（GSP1和GSP2分别地）据描述巢式引物有助于你的PCR产品的分析。如果必要的话它们可以为巢式RACEPCR使用。在第四部分会详细描述引物设计。图表三显示用在SMARTerRACE反应中的引物与模板的关系。IV检查RNA模板的质量RNA的纯度对cDNA的合成和SMARTerRACE成功是关键因素。最主要是对cDNA的合成，必须保证你的RNA是完整的无污染的。V.CRACE准备的第一条cDNA链的合成自从SMART技术的好处是5'伸长只与5'RACE相关，SMARTerRACE试剂盒包括一个包括两个独立的cDNA群的合成协议的:5'RACE准备cDNA和3'RACE准备cDNA。5'RACEcDNA是利用一个修饰的锁定对接低聚（dT）引物和如前面所述的theSMARTerIIAoligo。这个修饰的低聚（dT）引物。称为5’-RACECDS引物A（5’CDS）在3’端有两个退化的核苷酸位点。在多聚腺苷酸尾巴的起始点的引物的核苷酸位点，因此排除了3’异质性固有低聚（dT）启动。3’RACE是用传统的反转录方法合成的，但就是用一个特殊的低聚（dT）引物，这个3’-RACECDS引物包括与5’CDS引物一样的锁定的核苷酸位点，在5’端也有一个SMARTer序列部分。通过将SMARTer序列整合到包括5’和3’RACE准备的cDNA群，你能用通用引物AMix启动RACEPCR反应，它能识别SMARTer序列