酵母双杂交文库构建基本实验流程第一链cDNA合成1.准备:高质量的PolyA或总RNA2.在微量离心管中混匀以下试剂：1–2μlRNA样本(0.025–1.0μgpolyA+或0.10–2.0μg总RNA)1.0μlCDSIII或CDSIII/6引物1–2μl去离子水(补齐体系到4.0μl)4.0μl总体积注意:对照实验时，请使用1μl*1μg+的对照RNA。CDSIII=Oligo-dT；引物CDSIII/6=随机引物3.72°C，孵育2min。4.冰上冷却2min，然后14000rpm，10sec，瞬时离心。5.混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的RNA样本中，轻拍混匀。2.0μl5XFirst-Strand缓冲液1.0μlDTT(100mM)1.0μldNTP混合物(10mM)1.0μlSMARTMMLV反转录酶9.0μl总体积6.只有使用随机引物(CDSIII/6)实验才进行此步骤[如果采用Oligo-dT(CDSIII)请忽略此步骤，直接进行Step7]，25°C，室温孵育10min。7.42°，孵育10min。注意:孵育在热盖的PCR仪中进行。若用非热盖的PCR仪或水浴，请在反应管中加入一滴矿物油来避免水分蒸发。8.加入1μlSMARTIII-modifiedoligo，混匀，42°C，孵育1hr。9.75°C，10min终止第一链合成反应。10.室温冷却，加入1μlRNA酶H(2U)。11.37°，孵育20min。12.继续进行LD-PCR扩增(SectionVII.B)。注意:–20°C下可保存3个月。第一链反应最终体积为15μl•10μlSMARTIIIOligo(10μM;5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTATGGCCGGG-3’)•10μlCDSIII引物(10μM;5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-d(T)30VN-3’)*23个碱基•10μlCDSIII/6引物(10μM;5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-NNNNNN-3’)注意:N=A,G,C,orT;V=A,G,orC•50μl5’PCR引物(10μM;5’-TTCCACCCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)25个碱基•50μl3’PCR引物(10μM;5’-GTATCGATGCCCACCCTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)1/4酵母双杂交文库构建基本实验流程第二链cDNA合成（LD-PCR）尽量使用最小的循环数来得到3-6ug的dscDNA。TableIII中最优的循环数取决于对照小鼠肝脏RNA的起始量。最优循环数随着模板量、物种的不同而变化。这个程序是经过优化适用于Advantage2聚合酶混合物(Cat.No.639201)。使用其他的酶时需要摸索最优循环数。TableIII:RNA起始量与PCR循环数的关系总RNA(μg)PolyA+RNA(μg)循环数（个）1.0–2.00.5–1.015–200.5–1.00.25–0.520–220.25–0.50.125–0.2522–240.05–0.250.025–0.12524–261.准备:•第一链cDNA(SectionVII.A)•热盖PCR仪2.建立两管100ul的扩增体系，一个是实验组，另一个是对照组：2μl第一链cDNA(SectionVII.A)70μl蒸馏水10μl10XAdvantage®2PCR缓冲液2μl50XdNTP混合物2μl5’PCR引物2μl3’PCR引物10μl10X溶解液2μl50XAdvantage2聚合酶混合物100μl总体积3.扩增程序:•95°C30sec•xCyclesa95°C10sec68°C6minb•68°C5mina参考TableIII设定PCR循环数。b扩增程序每过一个循环时延伸时间增加5sec。例如，在第二轮循环中，延伸时间应该是6min和5sec，如此叠加。4.对每个样品取7μlPCR产物，使用0.25μg的1kbladderDNA分子量标记在1.2%的琼脂糖/EtBr进行电泳进行分析。注意:如果实验样本没有出现图中所示的结果，请参考疑难解答指南(SectionX)。5.柱纯化(SectionVII.C)后，可将dscDNA在–20°C保存待用。2/4酵母双杂交文库构建基本实验流程CHROMASPIN™+TE-400纯化柱纯化dscDNA1.准备:•LD-PCR扩增dscDNA