会计学WesternBlot是将蛋白质样品经过SDS-PAGE分离(fēnlí)后，通过转移电泳或直接印渍方式原位转印至固相介质上，并保持其原有的物质类型和生物学活性不变，然后应用抗原-抗体反应进行特异性检测。本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，可分辨10-100ng的蛋白质，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。一、实验(shíyàn)原理WesternBlot法又称免疫印迹法（IBT），分三个阶段进行。第一阶段：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。第二阶段：电转移。第三阶段：固相酶免疫测定。/二、试验(shìyàn)方法（一）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1.试剂材料(cáiliào)1)30％凝胶贮备液：含29％（W/V）丙烯酰胺和1％（W/V）N，N-亚甲双丙烯酰胺，用去离子水配制，避光贮存于棕色瓶中。2)10％SDS，去离子水配制，贮存于室温中。3)TEMED（N,N,N′,N′-四甲基乙烯二胺）。4)10％过硫酸胺：用无离子水配制少量，最多4℃贮存一周。5)浓缩胶电泳缓冲液Tris-HCl（PH6.8）。分离胶电泳缓冲液Tris-HCl（PH8.8）。6)电泳缓冲液：Tris-甘氨酸（PH8.3）。7）上样缓冲液：100mmol/LTris-Cl（PH6.8）200mmol/L二巯基乙醇10%SDS0.2%溴酚兰20%甘油8）ENA：用pH7.40.01MPBS从牛胸腺丙酮(bǐnɡtónɡ)粉中抽提，浓度为5mg/mL，-70℃保存备用。9）垂直电泳槽、电泳仪、稳压器、微量加样器、滴头、EP管、吸管等。10）考马斯亮蓝染液、丽春红染液。2.实验方法1)玻璃L准备(zhǔnbèi)：依次用水、10％SDS、H2O、乙醇和水冲洗，干燥。2)配制分离胶：总量5mL，其中：水1.65mL30％丙烯酰胺溶液2.0mL1.5mol/LTris-HCl（PH8.8）1.25mL10％SDS0.05mL10％过硫酸铵0.05mLTEMED0.002mL3)配制浓缩胶：总量2ml，其中：水1.385mL30％丙烯酰胺溶液0.325mL1.0mol/LTris-HCl（PH6.8）0.25mL10％SDS0.02mL10％过硫酸铵0.02mLTEMED0.002mL将配制好的浓缩胶注入分离胶上端，插入梳子，应小心(xiǎoxīn)避免气泡。（二）电转移：蛋白(dànbái)蛋从SDS-聚丙烯酰胺凝胶转移至PVDF膜一、材料转移(zhuǎnyí)缓冲液、转移(zhuǎnyí)电泳槽、电泳仪、稳压器、PVDF膜、Whatman3MM滤纸、海绵等二、方法1．剪6块滤纸和一块PVDF膜，其大小应与SDS凝胶的大小相同。如果纸或膜比凝胶大，在转移过程中会形成局部短路影响转印效果(xiàoguǒ)。2．将剪好的3MM滤纸及PVDF膜在甲醇中提前浸泡5-10min。3、按下列过程安装转移装置：（1）将塑料支架平放在含有转移缓冲液的托盘中，在塑料支架上放一块(yīkuài)海绵。（2）将3块3MM滤纸对齐放在海绵上，依次放置PVDF膜、凝胶、另外3块3MM滤纸及海绵。在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡，若有气泡残留，则影响转移效果。（3）最后用塑料支架夹紧上述各层，放入电转移槽内，注意PVDF膜一侧靠正极，胶一侧靠负极。4、接通电源，电压40V，电流0.17-0.2A，转移1.5-6h，转移时间可根据靶蛋白的大小来定，蛋白质分子量小则需时短，蛋白质分子量大需时长。5、转移结束后，取出塑料支架，依次去掉各层，用铅笔在膜的上缘作好标记(biāojì)。6、切下部分PVDF膜，丽春红染色观察转印情况。7、在标记(biāojì)好的上缘用蘸有人IgG的钢笔划一条线。（三）固相酶免疫测定检测ENA（extractablenuclearantigen）自身(zìshēn)抗体一、材料1、洗涤液：含0.05％吐温-20℃的PH7.4的PBS2、酶标抗人IgG3、阴性(yīnxìng)对照血清、阳性对照血清4、底物溶液5、终止液6、已转印有ENA的PVDF膜。7、恒温摇床、微量加样器、反应槽、塑料袋、滴管、吸管等。二、方法(fāngfǎ)1．切下数条已转移有ENA的PVDF膜。2．封闭（用1％的牛血清白蛋白4℃过夜）。3．洗涤液漂洗5次，每次1min。4．加样：1mL洗涤液加入20μL血清，37℃恒温摇动40min。5．洗涤液漂洗5次，每次1min。6．加入1mL酶标羊抗人IgG，37℃恒温摇动30min。7．洗涤液漂洗5次，每次1min。