CLSI临床微生物实验室标准解读葡萄球菌CLSI临床微生物实验室标准解读第一辑2009年CLSI(M100-S19)中葡萄球菌属药敏更新部分中国医学科学院北京协和医院王辉陈宏斌2009年CLSI在版式上的显著变化是将K-B法和MIC法放在同一个表格中，方便比较。对于葡萄球菌属，主要有以下更新和变化：一是去除凝固酶阴性葡萄球菌苯唑西林纸片扩散法试验；二是删除了万古霉素纸片扩散法的药敏折点；三是增加了金葡菌莫匹罗星高水平耐药性的检测。一、β-内酰胺类的变化2009年CLSI指出在报告青霉素对葡萄球菌敏感之前，即当MIC≤0.12μg/ml或抑菌圈直径≥29mm，需要做可诱导的β-内酰胺酶试验。其操作如下：将分离菌株传种至血平皿或MH琼脂上，贴上作为诱导子的苯唑西林或头孢西丁纸片，35℃孵育16-18h，挑取抑菌圈边缘的细菌做b-内酰胺酶试验。b-内酰胺酶试验阳性可以预测青霉素、氨苄西林、阿莫西林、羧苄青霉素、替卡西林、美洛西林和哌拉西林耐药。在检测MRS时，金葡菌、路登葡萄球菌和其它凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)对苯唑西林的折点和选取的药敏方法有所不同，具体见表1(见下页)。在CoNS(除外路登葡萄球菌以外)中，由于苯唑西林纸片扩散法存在太多假―R‖，所以此法被去除，而是采用头孢西丁纸片法、苯唑西林/头孢西丁MIC法检测mecA介导的苯唑西林耐药。对于由CoNS(除外表皮葡萄球菌)引起的严重感染，当苯唑西林MIC值在0.5-2μg/mL之间时，应当检测该菌株是否产mecA基因或PBP2a(图1)。利用头孢西丁检测mecA介导的苯唑西林耐药所推荐的质控菌株是金葡菌ATCC25923-mecA阴性(抑菌圈直径23-29mm)和金葡菌ATCC43300-mecA阳性(抑菌圈直径≤21mm)。图1CoNS*苯唑西林MIC结果报告策略表1.MRSA的检测方法及判定折点抑菌圈直径折点MIC解释标准菌名药物浓度备注(mm)(mg/mL)SIRSIR1mg苯唑西头孢西丁可以用金葡菌≥1311-12≤10≤2-≥4林纸作苯唑西林耐药检测1mg苯唑西路登葡萄球菌---≤2-≥4的替林代药。根据头孢金葡菌、路登葡≤4≥830mg头孢西西丁萄≥22--(头孢西-(头孢西丁的结果报告苯唑球菌丁)丁)西林CoNS(除外路登敏感或耐药葡1mg苯唑西林---≤0.25-≥0.5萄球菌)CoNS(除外路登30mg头孢西葡≥25-≤24---丁萄球菌)二、糖肽类耐药性的检测2009年CLSI推荐采用MIC法检测所有葡萄球菌对万古霉素的敏感性，去除了纸片扩散法。这是因为纸片扩散法不能区分万古霉素敏感、中介耐药的葡萄球菌。图2显示采用Etest测定万古霉素对金葡菌的MIC为8mg/ml，为―I‖，而采用纸片扩散法，抑菌圈直径为17mm，为―S‖。万古霉素纸片扩散法仅仅对于检测含vanA的金葡菌(VRSA)是可靠的。如果抑菌圈直径≥7mm，需要检测万古霉素的MIC值。对万古霉素MIC值升高的金葡菌(MIC≥4mg/mL)和CoNS(MIC≥8mg/mL)需要送往参考实验室进一步确证。目前的研究没有重新评估替考拉宁纸片扩散法的折点，因此纸片扩散法能否将替考拉宁中介、耐药的葡萄球菌与敏感的菌株区分开来还不清楚。2009CLSI明确指出采用含6mg/ml万古霉素脑心浸液(BHI)琼脂筛选万古霉素MIC≥8mg/ml的金葡菌，具体步骤如下：制备含6mg/ml万古霉素脑心浸液(BHI)琼脂，将待测菌株调整到0.5麦氏单位菌悬液，用加样枪吸取10ml菌悬液点种到制备好的琼脂板上，或者是用菌悬液浸湿棉签并拧干多余的液体，在制备好的琼脂板上点种直径10-15mm的面积，35±2℃空气孵育24小时，>1个菌落或薄膜生长即可推测为万古霉素敏感性下降金葡菌。进一步的试验是用确证的MIC方法检测在筛选平皿上生长金葡菌对万古霉素的MIC值。BHI琼脂筛选法不能稳定地检测所有万古霉素中介金葡菌，一些万古霉素MIC为4mg/ml的金葡菌不能在琼脂板上生长。推荐的质控菌株是粪肠球菌ATCC29212(敏感)和粪肠球菌ATCC51299(耐药)。异质性万古霉素中介金葡菌(hVISA)是指子代中含万古霉素MIC值8-16mg/ml的细胞，大多数发生于万古霉素治疗的病人，hVISA可能造成万古霉素治疗失败。采用标准的万古霉素MIC试验，一些hVISA的MIC值在1-2mg/ml之间，CLSI中还没有检测hVISA的特异方法。图2采用CLSIM100-S18万古霉素纸片扩散法折点，将―I‖金葡菌错误地判断为―S‖(此图片来自