PAGE博士研究生开题报告指导老师：佟倜学生：武文斌学号：2009731077PAGEPAGE3吉林大学第二医院博士生开题报告研究方向(题目)：靶向键合紫杉醇纳米胶束对食管癌细胞株EC9706的抗肿瘤效应研究年级：2009级专业：普胸外科姓名：武文斌指导教师：佟倜教授一．研究目的、意义（理论或实践意义）：食管癌是全球肿瘤发病率第8位，死亡率第6位。我国是食管癌多发地区，是肿瘤死亡常见病种之一。诊断食管癌的患者治疗以手术切除病灶为主，放疗与化疗为辅，总体5年生存率为18.1%-40.8%。因此手术之外的热疗，辅助化疗与新辅助化疗，靶向治疗，联合放疗等综合治疗手段亟待改进与创新。为提高患者手术后生存率与生活质量，靶向化疗方案的改进成为研究重点与热点之一。紫杉醇是近年广泛应用的广谱抗癌药，但存在来源有限而价格较贵、难溶于水而其有机溶液制剂存在严重过敏反应等毒副作用。耐受性差，等各种缺陷致其应用受限。因此，有必要改变其剂型，改善水溶性，以降低其毒副作用，并应用靶向技术，设计新型靶向载体，提高肿瘤组织的药物浓度。长春应化所人工合成高分子键合紫杉醇经动物实验研究证实，具备肿瘤组织特异性浓积效应；而叶酸紫杉醇混合胶束经初步实验证实存在叶酸-叶酸受体介导的主动靶向效应，因此新型紫杉醇键合药同时具备被动靶向作用（EPR效应）与主动靶向效应，增强了其抗肿瘤有效性与特异性，并降低了油剂紫杉醇的毒副作用。此外，双亲性结构可自组装成纳米胶束，紫杉醇包在其中，屏蔽了免疫系统，延长药物的血液驻留时间；分子结构和分子量具有可控性，可根据需要调控紫杉醇含量，达到2030%；高分子可生物降解，体内无残留；以及良好的水溶性与极低的免疫原性。预测其具备良好的临床应用前景与可预期的社会经济效益。本项研究作为长春应化所自然科学基金的一部分，与我院胸外科合作进行。对人工合成键合紫杉醇抗食管癌细胞株作用的研究可为该药临床前实验与分期临床实验提供理论依据。二．目前国内外对该课题的研究简况：1.长春应化所人工合成聚乙二醇聚乳酸高分子键PEG－PLA技术已成熟；并具备应用此载体进行大剂量制备键合紫杉醇与叶酸紫杉醇混合胶束的经验。将载有药物分子、靶向基元和荧光探针的相同骨架的双亲嵌段聚合物组装成纳米胶束，使其具有药物缓释、靶向输送和靶向示踪等多种功能。经Medline与PubMed文献检索，该剂型紫杉醇为首创新型药物。已发表相关文章。2.长春应化所已完成键合紫杉醇纳米胶束对C6脑胶质瘤细胞、Lewis肺癌细胞、SKOV3卵巢癌细胞的体外实验与小鼠体内实验，初步证实其抗肿瘤活性优于单纯紫杉醇制剂，对肿瘤组织存在特异性浓集效应。3.国外有将其他高分子作为药物载体的键合紫杉醇研究，有报导已进入临床1期实验，尚无统计分析的临床资料报导，且无键合紫杉醇胶束投入临床应用报道。此外，键合紫杉醇纳米胶束，以及与叶酸紫杉醇混合胶束对食管鳞癌细胞系的抗肿瘤效应未见报道或相关研究，因此本实验研究EC9706/EC109细胞株的抑肿瘤与促凋亡效应。三．研究内容：1.中科院长春应化所组装合成携带叶酸配体的聚乙二醇聚乳酸紫杉醇纳米胶束，观察其电镜特点，物理化学性状，水溶性及液体中分布特点，紫杉醇纯药的缓释效应，药代学，药动力学。2.复苏并培养人源性食管癌细胞株EC9706/EC109，进行体外细胞实验，验证其抗肿瘤细胞增殖并促凋亡的作用。叶酸受体试剂盒检测肿瘤细胞表面叶酸受体的相对表达量。验证新剂型紫杉醇的叶酸基元与肿瘤细胞表面的叶酸受体特异结合率。观察肿瘤细胞对同一浓度不同剂型紫杉醇的吞噬率差异性。3.构建裸鼠人源性食管癌模型，构建模型成功后，随机分组，应用各型紫杉醇，研究其抑瘤率，凋亡率，凋亡相关蛋白、RNA的表达变化；对荷瘤鼠的生存期影响，生存分析。4.总结实验并依据统计学原理分析实验结果，撰写实验论文。四．研究方法:1.应化所合成药物后，共聚焦显微镜观察理化性状；荧光标记法检测胶束对肿瘤组织靶向性与特异性浓集效应，在小鼠体内各脏器的分布与浓集情况。共聚焦显微镜观察药物作用后肿瘤细胞的形态学改变等。2.细胞培养与体外实验：EC9706/EC109肿瘤细胞株的培养，取对数生长期细胞种96孔板与6孔板，应用MTT法检测抑瘤率，PI单染法经流式细胞仪测细胞周期阻滞相、双染法经流式细胞仪检测凋亡率，TUNEL法测凋亡率；RT-PCR、WesternBlot法检测凋亡相关蛋白survivin，Bcl-2，Bax，Caspase3的表达变化。3.检测肿瘤细胞表达叶酸受体量。提取总蛋白，用叶酸受体试剂盒ELISA法。4.皮下肿瘤细胞悬液注射，构建裸鼠EC9706移植瘤模型，随机分组，检测肿瘤组织体积与重量，统计各组药物的抑瘤率差异；研