果树学报,一批把分析体系的建立与应用吴锦程‘,杨向晖“,林顺权’’福建省莆田学院环境与生命科学系,福建莆田华南农业大学园艺学院,广州摘要为研究批把种质资源遗传多样性和亲缘关系的技术平台奠定基础,以来自个不同国家份批把种质为试材研究批把基因组反应体系。通过检测分析中提取、酶切及连接、预扩增和选择性扩增的结果,对影响分析的主要因子进行分析,建立了分析体系。利用该体系并选用一一引物组合对供试材料进行扩增,获得的条带清晰可辩,说明所建立的反应体系适合于批把进行〕分析。关键词批把计基因组中图分类号文献标识码文章编号一一一职一‘,一,一,’阳叩五城瓜毋,凡‘。岁,几,几梦’岁、,议扭耐加。年召口刀召艺姚心口刀刀口草理少叩‘·五兔明甲乙湘。,叮,一,一日笼廿罗芦一一化卿肠明呷印即种有特色的亚热带水果,已有多年的栽培历扩增片段长度多态性,是由荷兰科学家等创史,中国是世界批把生产第一大国。批把自唐代传建发展起来的一种检测分子多态性的新方法。人日本后,迄今已分布到全世界的多个国家,东亚该技术是基于选择性扩增基因组限制性和地中海沿岸是世界批把栽培两大较集中的产区,酶切片段而检测多态性的一种指纹技术,它已形成大量的批把品种资源,但对其缺乏系统的研综合了的高效性和的稳定性强、重复究。目前关于批把分析未见报道,为此笔者建性好的优点。由于可采用不同的人工接头、不同限制立了批把分子标记研究的技术体系,为进一性酶的组合以及不同选择碱基数目的组合,因此步开展批把种质资源的分子生物学研究奠定基础。具有多态性高、检测位点多、用量少、无,材料和方法需预知基因组序列信息等优点是迄今为止效率最高的分子标记,但分析对模板质量要材料求很高。分析目前广泛应用于种质资源遗传供试材料取自华南农业大学批把种质资源圃的。多样性和亲缘关系、图谱构建、基因定位、基因克隆、个普通批把品种表取年生枝条上新叶刚基因表达与调控等研究阅。露尖未展叶或刚展叶时摘取健康嫩叶为取样最佳时批把叩〕为原产中国的一期叶片转绿时取样已晚,所提取的质差量收稿日期一一接受日期一一基金项目福建省科技厅资助重点课题。作者简介吴锦程,男,副教授,主要从事植物资源的改良与利用研究。一,一叼·通讯作者。二一,一王、期吴锦程等批把分析体系的建立与应用少放人自封塑料袋气温高路程远时应置于冰壶杂质及部分绒毛不可伤叶再用蒸馏水冲洗次内并及时带回实验室于水中用手轻轻擦洗以除去吸水纸吸干后备用或放人一℃冰箱保存待用表供试批把品种及其来源月布试剂叫林一林总体积林,提取液一离心数秒混匀℃保温后经℃保温℃伽十过夜℃冰箱中保存备用若长期保存可贮于℃六烷基三甲基嗅化钱使用前加人的一冰箱内琉基乙醇预扩增反应于离心管中加人缓冲液缓冲液协林一林酶协林酶切与连接分析试剂试剂盒和分子协林总体积协按照下量标准入十购自北京鼎国生物技列程序进行预扩增℃℃升℃术有限责任公司实验所采用的和升℃共个循环℃延伸℃由华美生物工程公司生产琼脂糖为将预扩增产物用一按稀释于℃冰箱分装产品丙烯酞胺和一亚甲基双丙烯酞胺为保存待用一℃可长期保存公司生产的分装产品选择性扩增反应反应体系为提取缓冲液协林参照刘月学等的方法提取并用协丑酶林林核酸蛋白检测仪检测浓度和纯恤协留林度调整浓度至枢琼脂糖凝胶电林协预扩增稀释林总体积泳检测林选择性扩增反应的程序℃℃分析体系的建立℃时℃共个循环每个循酶切与连接酶切与连接体系为离环温度递减℃℃升℃斗℃心管中加林林协共个循环℃延伸℃林模板彭协协凝胶电泳分析用含尿素的林林毛林林缓冲液配制聚丙烯酞胺凝胶丙烯酞胺果树学报卷,’一亚甲基双丙烯酞胺,插人的尖齿梳子厚度为提取批把植物,所获得的呈乳白色,。于恒功率、℃条件下预电泳。室温干燥后沉淀呈无色透明状,易溶于选择性扩增产物与甲酞胺上样液甲酞胺,,在叩核酸蛋白检测仪上测定姗。,、,。班,嗅酚蓝以加于和,川值以检测核酸纯度经检测其姗扩珊二离心管充分混匀并离心,将其置于℃变性后比值均为一。经琼脂糖凝胶电泳检测得立即冰浴,每个齿孔中点样刀林。恒功率、到明显的主带,所提取的完整无降解图。℃下电泳至嗅酚蓝近胶底部约需。电泳后凝同时酶切及连接后的产物经琼脂糖凝胶电泳胶经冰醋酸固定、染色、无水。加检测结果显示酶切消化完全图,说明该方甲醛及硫代硫酸钠显影,胶版干后扫描拍照。法能有效降低多酚及多糖等次生代谢物质对的污染而获得高质量的。结果与分析酶切及连接一蛋白酶法提取的效果采用六碱基位点识别酶肥四碱基,采用改进的法即一蛋白酶法位点识别酶种酶及毛连接酶对进行图总的电泳检测、入、一分别是乌躬白、解放钟、、、、罗行、、