Westernbloting小结——刘高华Westernbloting基本流程1蛋白液的提取2蛋白液浓度的测定3凝胶的制作4电泳5转膜6一抗的加入以及孵育7二抗的加入以及孵育8清洗抗体准备显影以及成片和分析具体操作1蛋白液的提取；用PBS也清洗细胞三次，然后弃液，加入裂解液（裂解液中已经加入了蛋白酶抑制剂按体积100:1加入）200ul反复冲洗，浆细胞冲向最低端以便能够尽可能多的收取到细胞及蛋白液，将上述液体置于冰上（充分震荡后）约10min，然后离心14000r/min6min收集上清液。将上清液取出6ul稀释成20倍（通常所用的稀释液都和标准液所用的稀释液相同）。取25ul加入板孔中，用BCA混合液200ul加入板孔中（bcaA：bcaB=50:1）37度孵育30分钟，用于蛋白浓度测试仪测得吸光值。按说明书配制标准蛋白溶液，并测取吸光值。根据以上信息算出蛋白浓度。样品的处理，向样品中加入loadingbuffer,并将其稀释成一倍，于沸水中水浴30min,收藏于冷冻冰箱中。2凝胶制作，按照要测的蛋白质分子量大小，设计好凝胶的浓度，按照比例加入原液，配制分离胶沿玻璃板边缘开始灌胶，到达梳子下缘半公分左右时，停止灌胶，用无水乙醇液封，待分离胶凝固了，开始灌浓缩胶，同时插好梳子，等待胶的凝固（第一块胶凝固后立即开始灌第二块胶，最后不要超过半小时）灌好胶以后准备加样，如果第二天才能加样，则可以把胶保存在电泳液中，同时用保鲜膜保鲜，主要保持凝胶是湿度。加样的时候要注意小心把凝胶弄破，小心样品从加样孔中溢出来，加样时，尽量靠近加样孔一边缘，使得样品尽量都沉积在加样孔中，需要加marker，marker的选取根据蛋白质的大小来定，加完了后准备电泳。电泳时电流30MA电压47V，电泳时间不固定，当蓝色条带跑到最低端的时候就可以了。转膜。转膜的目的是将凝胶上的蛋白条带转换到纤维素膜上，以方便显影观看成果，转膜要注意其他蛋白成分将膜污染，造成非特异性的背景，故而切记注意。将转膜槽打开，海绵垫一分为二，用两张吸水纸铺于底层海绵上，然后用转移液将其打湿，用平铺板压平赶出气泡（主要用于保持纤维素膜的湿润）将凝胶铺于吸水纸上，纤维素膜铺于凝胶上，上层在铺两张吸水纸外层用海绵覆盖，整个过程中不间断的用转移液打湿以上结构，纤维素膜需要首先用无水甲醇侵泡，取凝胶的时候小心将凝胶弄坏了，然后接通电源，小心不要将正负极接错了，否则可能电泳后蛋白就没有了。转移的时候温度比较高，通常用冰块来降温，转移时需要加用转移液。转移电压一般单个为120---130V双个为150----200V，转移电流一般单个为300MA双个的时候400MA（此为机器上线，要是可以的话也可以采用500MA的）。转膜时间不定，根据经验来做，若蛋白质为30---100KD则2小时，若100---200KDA则两个半小时。5转膜后把膜取出来置于平皿中加包被液于摇床上1个小时，后用保鲜膜封装加入一抗进行过夜孵育，4度环境。其中一抗需要稀释，其稀释倍数来自于预实验，通常预实验所用的倍数为抗体本身说明书的两倍，根据与实验的表达情况，在正式试验的时候做出相应上调和下调的处理，封装的时候注意要将包装里面的气体尽量弄出来，主要目的是有气体在可能导致孵育不完全。次日取出膜置于中，TBST洗三次，用DDH2O侵泡后准备加二抗，于常温下孵育2小时，后取出膜，再次用TBST洗三次，用DDH2O侵泡准备显影。显影即将纤维素膜上的蛋白条带通过荧光的方式显现出来，然后通过胶片呈现出来，其所用药品是为ECLA+B，在暗室中将上述混合液加于纤维素膜上，通过红外线灯的反复照射可以出现荧光，视显影情况酌情增加混合液，将膜转移到压片夹上，用保鲜膜铺于上面，再次开关红微灯，观看显影情况，然后用胶片压片，视显影情况决定压片时间才长短，一般情况时间为1到5分钟，然后定影和显影。分析显影片的情况。拿到胶片的反应应该是看到的条带是怎样的，是否是平行的，各条带之间的辉度如何，通过和对照组的对比后，分析不同因素对细胞的影响后导致该种蛋白的高表达还是地表达的问题。如果辉度过于离谱，则可酌情增加内参实验。内参实验将westernbolt的纤维素膜取出封装后于沸水中水浴3分钟，然后进TBST洗涤和去离子水洗涤，过程和westernbolt大致一样，只是清洗的次数少一次（因为其背景的成分是已经看到过了的），然后加一抗和二抗，都和前面的步骤一样，只是抗体的不同而已。目前的内参实验主要有三种：GAPDHbeta-actin和beta-tubulin液体配制TBST4L=去离子水+TBS400ml+tween202mlPH=7.0-7.4包被液2.5g脱脂奶粉+50mlTBST摇匀转移液700ml去