基于MALDI-TOF质谱技术的病原体快速检测病原体临床检测需要有高通量，高精确度，快速的技术方法。基于质谱测定的病原体检测技术既纳入了PCR技术的优势，可以对微量或无法体外培养的病原体进行扩增，同时也融入了MALDI－TOF质谱检测的RNA片段的快速、精确、高通量的特性。我们确定了一些常见细菌的管家基因（如16sRNA，DNAGyrase，Hsp70等）的特定片段，尽管它们高度保守，但仍在序列上存在一定的差异。经过PCR扩增，体外转录以及核酸内切酶RNaseT1作用，这些差异将产生不同的RNA片段质谱图谱，以作为细菌鉴别的标准。实验材料实验方法通过BLAST我们确定了16SrRNA，Hsp70，RNAPolB等候选管家基因，通过Clustal将不同细菌的管家基因序列比对，我们寻找长度在300-600bp,保守性较低的区域作为目标片段。再目标片段上下游设计通用引物，其中正向/负向引物5’端分别附加有T7（Gtaatacgactcactataggg）/Sp6(Atttaggtgacactatagaa)启动子序列。结果与讨论用标准样品探求不同基质的效果由图可见，ATT和THAP为基质时,标样的峰图比较杂，且不见约5800Da的大片段。而以3-HPA为基质的组中,标样的峰比较清晰，强度比较大，并且清晰可见三个标样的峰，与理论质量相符合。考虑到长的核酸片段将能更好的作为区分不同的细菌，我们希望尽可能多的检测到清晰的大片段的质荷比信息，因而我们初步选定用3-HPA作为基质进行细菌样品研究。由图可见，对于同样的RNA酶解样品，由于溶液中含有PCRbuffer，转录buffer，酶，dNTP，NTP等成分，可以比较得出ziptip脱盐效果比oligobeads脱盐效果好很多。ziptip脱盐得到的质谱峰图中每个峰清晰，峰强度高，并且检测到的峰的数量也大大多余oligobeads组。由此我们最终决定选用3-HPA作为核酸检测的基质，并采用ziptip脱盐方法。E.Coli与Salmonella图谱比对可以看出，图谱的整体趋势是比较类似的，特别是对于一些强度较高的峰以及质核比较小的峰，在两张图谱中均可找到。可能的解释是因为首先管家基因在不同细菌种类间本身保守，并且16sRNA基因又是其中高度保守的一种，这点在我们进行引物设计的时候已经发现。另外，较小的峰代表较短的片段，在基因组中本身重复出现的几率就大一些。但是我们仍然可以在两张图谱中找到一些独特的峰，这些峰将可能可以作为区分这两种细菌的标准之一。a1.E.coli16sRNAb1.S.typhimurium16sRNAc1.E.coliDNAgyrased1.S.typhimuriumDNAgyrasee1.E.colihsp70f1.S.typhimuriumHsp70由于目测质谱图谱的局限性，我们尝试设计一种计算方法用于比对质谱数据和理论酶切得到的质量。Matching-Score=(CI*2+DI*5+UI*1)/(CI+NI+UI)Commonions(CI),ionssharedbyE.coliandSalmonellaDiscriminativeions”(DI),orionsthatcandiscriminateE.coligenesfromS.typhimuriumUnmatchedions”(UI),orionsthatdon’tfitintotheaboveCIandDI以大肠杆菌以及沙门氏杆菌为例，选取了16sRNA，Hsp70，DNAGyrase特定片段，初步建立了运用质谱分析RNA片段以鉴定常见细菌的方法：1.通过序列比对确定了16SrRNA，Hsp70，DNAGyrase等候选管家基因，并找到了合适质谱分析的基因片段。设计通用引物，其中正向/负向引物5’分别附加有T7/Sp6启动子序列。2.在进行体外转录时我们用amino-allo-UTP(aaU)替代UTP，增加了U与C间的质量差异，提高了方法的精确度。通过3次独立实验，得到可重复的候选基因片段RNA片段质谱图谱，证实了该方法的可靠性。3.比较了3-HPA，THAP，ATT三种用于核苷酸的Maldi基质以及ziptip与oligobeads的脱盐效果，最终优化了针对核苷酸样品的基质--3-HPA，以及脱盐方法-ziptip。4.通过将质谱数据与已知序列的理论酶切片段质量进行比对,将图谱数据与理论质荷比公差定为为±1Da，并将峰强度考虑进去，设计初步的算分方法，得到的结果基本符合我们的预期，但仍有待进一步验证和完善。