绪论什么是基因工程在体外对不同生物的遗传物质（基因）进行剪切、重组、连接，然后插入到载体分子中（细菌质粒、病毒或噬菌体DNA），转入微生物、植物或动物细胞内进行无性繁殖，并表达出基因产物。基因操作过程（简化过程）切、接、转、增、检（具体过程）1、目的基因的获取从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片段；2、重组体的制备将目的基因的DNA片段插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗体）的载体分子上；3、重组体的转化将重组体（载体）转入适当的受体细胞中；4、重组子的培养对转入重组子的受体细胞进行培养，以扩增DNA重组子或使其整合到受体细胞的基因组中；5、克隆鉴定挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）；6、目的基因的表达使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。SouthernblotSouthern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。NorthernblotNorthernblot是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northernblot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。Northernblot首先通过电泳的方法将不同的RNA分子依据其分子量大小加以区分，然后通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段。WesternblotWesternBlot中文一般称为蛋白质印迹。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。Easternblot双向检测蛋白质的技术。第二章工具酶（instrumentalenzyme）是应用于基因工程各种酶的总称，包括核酸序列分析、标记探针制备、载体构建、目的基因制取、重组体DNA制备等所需要的酶类。限制（restriction）限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片段。修饰（modification）细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能自身的限制性内切酶识别切割。限制和修饰作用在限制修饰系统中，限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性核酸内切酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制；而生物细胞(如宿主)自身DNA分子通过甲基化酶的作用，在碱基特定位置上发生了甲基化，可免遭自身限制性内切酶的破坏。限制－修饰作用实际就是细菌中的限制性内切酶降解外源DNA，维护自身遗传稳定的保护机制。限制性内切酶的类型与特点依据酶的亚单位组成、识别序列的种类和是否需要辅助因子分类。Ⅰ型限制性内切酶由3种不同的亚基组成的多亚基蛋白复合物。既具有内切酶活性又具有甲基化酶活性。酶作用所需的辅助因子除了Mg2+，还需要ATP和SAM(5—腺苷甲硫氨酸)。能够识别特异的核苷酸序列，识别序列不对称，距识别位点至少1000bp处随机切割。Ⅱ型限制性内切酶（在基因操作中起重要作用）由一种多肽组成，通常以同源二聚体形式存在。只具有内切酶活性。酶作用所需的辅助因子为Mg2+。能够识别特异的核苷酸序列，识别位点旋转对称，切割位点一般位于识别序列（多数为回文序列）内。Ⅲ型限制性内切酶由2种不同的亚基组成的蛋白质复合物，其中M亚基负责位点的识别与修饰，而R亚基则具有核酸酶的活性。酶作用所需的辅助因子除了Mg2+，还需要ATP和SAM(5—腺苷甲硫氨酸)。能够识别特异的核苷酸序列，识别序列不对称，切割位点距识别序列3’端24－26bp处。同裂酶（isoschizomers）来源不同，识别位点的序列相同的限制性内切酶。1、完全同裂酶识别位点和切割位点完全相同；2、不完全同裂酶识别位点相同，但切割位点不同。同尾酶（isocaudamers）识别序列不同，但能切除相同的粘性末端。Eg，BamHⅠ、BglⅡ、XhoⅡ等。星活性（staractivity）如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，成为星号（*）活性。限制性内切酶的星活性（staractivity）在非最适反应条件下（包括高浓度的限制性内切酶、高浓度的甘油、低离子强度、用Mn2+取代Mg2+、以及高pH值等等），有些限制性内切酶识别特定序列的特异性降低，例如原来识别六个核苷酸序列的酶变成识别五个或四个核苷酸