基因工程整理资料概论重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。基因工程:指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。基因工程的安全隐患1.对环境的影响2.新型病毒的出现3.癌症扩散4.人造生物扩散重组DNA技术与基因工程的基本用途：分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源；大规模生产生物活性物质；设计、构建生物的新性状甚至新物种基因工程诞生的理论基础：1.DNA是遗传物质2.DNA双螺旋结构3.中心法则和遗传密码基因工程的支撑技术：核酸凝胶电泳技术，核酸分子杂交技术，细菌转化转染技术，DNA序列分析技术，寡核苷酸合成技术，基因定点突变技术，聚合酶链反应（PCR）技术限制性内切酶：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4—8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶。*活性:如果改变反应条件就会影响酶的专一性和切割效率，称为星号（*）活性。Ⅱs型限制性内切酶:在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。连接酶：DNA的连接条件（1）必须是两条双链DNA。（2）DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）（3）需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+连接反应的机理1.ATP（NAD+)提供激活的AMP2.ATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi3.AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连4.AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5‘端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物5.3‘-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP两种DNA连接酶（1）大肠杆菌连接酶只能连接粘性末端（2）T4噬菌体的连接酶不但能连接粘性末端，还能连接齐平末端影响连接反应的因素1.插入片段与载体的浓度比例2.反应温度一般14~16℃DNA聚合酶基因工程中常用的DNA聚合酶1.大肠杆菌DNA聚合酶2.Klenowfragment3.T7DNA聚合酶4.T4DNA聚合酶5.修饰过的T7DNA聚合酶6.逆转录酶常用的DNA聚合酶的特点共同特点：把dNTP连续地加到引物的3’—OH端。主要区别：持续合成能力和外切酶活性不同。各聚合酶的性质：DNA聚合酶3’5’外切5’3’外切酶活性聚合速率持续能力酶活性大肠杆菌DNA聚合酶低有中低Klenowfragment低无中低T4DNA聚合酶高无中低T7DNA聚合酶高无快高化学修饰T7DNA聚合酶低无快高遗传修饰T7DNA聚合酶无无快高逆转录酶无无低中TaqDNA聚合酶无有快高DNA聚合酶I（PolI）的反应条件①底物：dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP）②Mg2+③带有3’—OH游离端的引物④DNA模板核酸探针：能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核苷酸分子放射性标记的优缺点优点：制作简单、高比放射性、放射自显影效果好。缺点：半衰期短（32P只有14.3天）、不易保存、对人体有害、要求在专门实验室操作。用非放射性标记的探针检测原理：探针DNA用生物素或地高辛标记。亲和素或地高辛抗体与生物素或地高辛特异性结合。亲和素或地高辛抗体与酶偶联。酶催化一个发光或显色反应。T7DNA聚合酶的用途①以大分子量DNA为模板的合成②进行末端标记③补平隐蔽末端合成补平3’隐蔽末端；水解修平3’突出末端修饰后的T7DNA聚合酶的用途①DNA测序双脱氧法。②标记DNA3’隐蔽末端③更有效地补平末端随机引物：随机顺序形成的寡聚DNA片断。DNA修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶①需要3’—OH、二甲胂酸缓冲液。②不需要模板！③底物可以是单链DNA、是3’—OH突出的双链DNA、平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。④随机添加的dNTPs。如果只有一种dNTP，就添加上同聚物。末端转移酶的用途（1）同聚物加尾（2）再生酶切位点（3）非放射性标记DNA片断的3’端T4多核苷酸激酶功能:催化磷酸从ATP转给双链或单链DNA或RNA的5’-OH端。不论5’-OH端突出与否。碱性磷酸酶功能:防止线性化的载体分子自我连接核酸外切酶是一类从多核苷酸链的一头开始催化降解核苷酸的酶。单链DNA外切酶1.大肠杆菌核酸外切酶I（exoI）5’3’外切识别5’-OH2.大肠杆菌核酸外切酶Ⅶ（exoⅦ）5’3’、3’5’外切识别3’-OH、5’-P双链DNA外