腺病毒包装操作手册（完整版）实用资料(可以直接使用，可编辑完整版实用资料，欢迎下载）汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度(PFU的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1:汉恒生物腺病毒载体附2:腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索(表达荧光的病毒附3:汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项(*非常重要!!!*1腺病毒相关实验请在生物安全柜(BL-2级别内操作。2操作病毒时请穿实验服,佩戴口罩和手套,尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。3操作病毒时需要特别小心病毒溅出。如果操作时超净工作台有病毒污染,请立即用70%乙醇加1%的SDS溶液擦拭干净。4接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。5如实验过程中需要离心,应使用密封性好的离心管,必要时请用封口膜封口后离心。6病毒相关的废弃物需要特殊收集,统一经高温灭菌后处理。7实验完毕后请用香皂清洗双手。➢腺病毒储存与稀释的注意事项1腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用,可将病毒放置于4℃保存(一周内使用完最佳;如需长期保存请分装后放置于-80℃。注:a.反复冻融会降低病毒滴度(每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%,因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。汉恒生物对病毒已进行分装(200μl/tube,收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。b.若病毒储存时间超过6个月,汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度(参见附表2-慢病毒滴度测定方法。2腺病毒的稀释需要稀释病毒时,请将病毒取出置于冰浴融解后,使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染混匀分装后置于4℃保存(一周内使用完最佳。重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统,在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。重组腺病毒具有以下几个显著优点:感染范围广,几乎可以感染所有的细胞系、原代细胞和部分组织;感染效率高达100%,可全面超越其他病毒载体工具和脂质体转染;对外源基因容载能力大(可以高达8Kb;不整合基因组;滴度高,操作方便。因此,重组腺病毒是一种最具有潜力的基因递送工具。目前常用的腺病毒载体基于人腺病毒5型(Ad5,其基因组是36Kb长的线性双链DNA。腺病毒可通过自身的纤维(fiber和细胞表面的受体结合被内吞进入细胞,然后从内吞体(endosome转移到细胞质和细胞核内,借助细胞的转录和翻译机器启动病毒的复制组装。一个完整的病毒生活周期会引发细胞死亡从而释放出病毒粒子。目前最常用的腺病毒包装体系有AdEasy和AdMAX两种,其共同特点是目的基因首先克隆到穿梭载体,然后再重组到腺病毒的大骨架上。这两个系统均具有腺病毒早期转录复制基因E1和E3的缺陷(ΔE1,ΔE3,其中E3基因对病毒产生并非必需。因此,腺病毒包装必需依赖表达E1的细胞系,例如HEK-293,HEK-293A等。相对于Adeasy系统,AdMAX系统操作便利,并且可以获得更好的病毒滴度。本操作说明均基于AdMAX系统,该系统由pHBAd系列穿梭质粒、腺病毒骨架载体pBHGlox(deltaE1,3Cre双载体组成。一、整体实验流程二、实验材料该病毒包装系统为两质粒系统,组成为穿梭质粒(pHBAd系列,包括包括过表达、干扰等类型和骨架质粒(pBHGlox(deltaE1,3Cre。1、载体信息(见附12、菌株:大肠杆菌菌株DH5α。用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。3、细胞株:293A,腺病毒的包装细胞,表达腺病毒基因E1,为贴壁依赖型成上皮样细胞,经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM+10%FBS+双抗(DMEM完全培养基。293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆,具有易使用和易转染的特性。该细胞株对于高细胞密度很敏感,当细胞超过70%汇合时,一些细胞可能会丢失它们的表型。若细胞密度持续在70%以下,则293A细胞能连续培养3~4个月维持原有的细胞特性。若以购买得到的293A作为第一代,则30代内都能得到最佳结果。随着传代次数的增加,293A细胞会出现生长状态变差、突变等现象。为了防止此类现象的出现,我们需要在初始阶段对细胞进行大量的冻存保种,以保证实验的稳定性和持续性。在细胞对数生长期进行冻存,可增加细胞复苏成活率。注:为了达到最好的细胞状态,提高腺病毒出毒效率,推荐在培养基中加入汉恒生物的SaveItTM抗支原体试剂。三、腺病毒包装和浓缩(一质粒构建和扩增构建有目的基因的腺病毒穿梭质粒和骨架质粒需经过大量抽提,浓度要求大