第一个要给大家讲得,就是它这个flowcell。Flowcell翻成中文,就叫“流动池”。我们来瞧这个图片。图片当中,我们瞧到一个象载玻片大小得芯片。这个芯片里面,就是做了8条通道。在这个通道得内表面,就是做了专门得化学修饰。它得化学修饰,主要就是用2种DNA引物,把它(2种DNA引物)种在玻璃表面。这两种(DNA引物得)序列就是与接下来要测序得DNA文库得接头序列相互补得。而且这2种引物就是通过共价键,连到Flowcell上去。之所以要用共价键连到Flowcell上去,就是因为接下来有大量得液体要流过这个Flowcell,只有有共价键连接得这些DNA,才不会被冲掉。这就就是Flowcell。再接下来,讲一下文库、与文库得制作(过程)所谓得DNA文库,实际上就是许多个DNA片段,在两头接上了特定得DNA接头,型成得DNA混合物。文库有2个特点,第1个特点,就是当中这一段插入得DNA,它得序列就是各种各样得。第2个特点,它得两头得接头序列,就是已知得,而且就是人工特地加上去得。要做这个文库,首先就是把基因组DNA,用超声波打断。然后打断之后,两头用酶把它补平,再用Klenow酶在3’端加上一个A碱基。然后,再用连接酶把这个接头给连上去。连好了接头得DNA混合物,我们就称为一个“文库”。英文也称作“library”。做好了Library之后,就要做桥式PCR了。桥式PCR,实际上就是把文库种到芯片上去,然后进行扩增,这样得一个过程。这个过程,首先就是把文库加入到芯片上,因为文库两头得DNA序列,与芯片上引物就是互补得,所以,就会产生互补杂交。杂交完了之后,我们在这里面加入dNP与聚合酶。聚合酶会从引物开始,延着模板合成出一条全新得DNA链来。新得这条链,与原来得序列就是完全互补得。接下来,我们再加入NaOH碱溶液。DNA双链在NaOH碱溶液存在下,就解链了。而且被液流一冲,原来得那个(模板)链,也就就是没有与芯片共价连接得链,就被冲走了。而与芯片共价连接得链,就被保留下来。然后,我们再在液流池里加入中性液体,主要就是为了中与这个碱液,在加入中与液之后,整个环境变成中性了。这时侯,DNA链上得另外一端,就会与玻璃板上得第二种引物,发生互补杂交。接下来,我们加入酶与dNTP,聚合酶就延着第二个引物,合成出一条新链来;然后,我们再加碱,把2条链解链解开;然后,我们再加中与液,这时侯,DNA链会与新得引物杂交。再加酶,再加dNTP,又从新引物合成出新得链来。连续重复这一过程,DNA链得数量,就会以指数方式增长。在桥式PCR完成之后,接下来要做得工作,就就是要把合成得双链,变成可以测序得单链。办法就是通过一个化学反应,把其中一个引物上得一个特定得基团给切断掉。然后,再用碱溶液来洗这个芯片。这时侯,碱让DNA得双链解链,那根被切断了根得DNA链就被水冲掉了。留下那根共价键连在(芯片)上面得链。接下来,再加入中性溶液,然后在这个中性溶液里面加入测序引物。好,接下来正式得测序工作就开始了。那么,在测序得时侯,加入进去得,最主要就是2个东西:一个就是HYPERLINK""\l"wechat_redirect"\t"_blank"带荧光标记得dNTP。而这个dNTP,它还有一个特点,它得3’末端就是被一个叠氮基堵住得。然后,再加一个聚合酶,聚合酶就会选择:哪一个dNTP就是与原来位置上得那个碱基就是互补得,根据互补性原理,把这个dNTP合成到新得这个DNA链上去。因为这个dNTP得3’端就是被一个叠氮基团堵住了,所以,它一个循环只能延长一个碱基。然后,它就停在那儿了。合成完了之后,就用水把多余得dNTP与酶给冲掉。冲掉之后,就放到显微镜下,去进行激光扫描。根据发出来得荧光来判断它就是哪个碱基。因为4种dNTP,它每一种dNTP上面标得荧光素都不一样,根据红、黄、蓝、绿,它出来得哪种颜色,那么,就可以倒过来推出来,这个新合成上去得碱基,就是哪种碱基。因为新合成得碱基,就是与原来位置(得碱基)就是互补得,所以,又推出模板上那个碱基就是哪个。这一个循环完成之后,就加入一些化学试剂,把叠氮基团与旁边标记得荧光基团切掉。切完了之后,3’端得羟基就暴露出来。再接下来,加入新得dNTP与新得酶,然后,又延长一个碱基。新延长完一个碱基之后,把多余得酶与dNTP冲掉,再进行一轮显微得激光扫描,再读一下这个碱基就是什么。不断重复这个过程,可以重复上百次,到几百次,就可以把上百个碱基,甚至更多碱基得序列读出来。那么,什么就是Index哪？就是因为Illumina得评委会个测序量很大,往往一个样本,用不了那么几亿条DNA。所以,科学家就想了一个办法。在文库得接头上做了一些标记,每一个样本,它有一个